ชุดทดสอบ RNAi HighYield T7

สำหรับใช้ในห้องปฏิบัติการทั่วไป การจัดส่ง: จัดส่งเป็นแพ็คเจล เงื่อนไขการจัดเก็บ: เก็บที่อุณหภูมิ -20 °C เพื่อหลีกเลี่ยงวงจรการแช่แข็ง/ละลาย อายุการเก็บรักษา: 12 เดือนหลังจากวันที่จัดส่ง คำอธิบาย: ชุด HighYield T7 RNAi ออกแบบมาเพื่อผลิต dsRNA (double-stranded RNA) จำนวนมาก> 200 bp ผ่านการถอดรหัส ในหลอดทดลอง โดยผ่าน T7 RNA Polymerase dsRNA ที่ได้ในภายหลังสามารถนำไปใช้ในแอปพลิเคชันการรบกวน RNA (RNAi) ได้ การเตรียม dsRNA ขนาดเล็กที่รบกวน ซึ่งเรียกว่า siRNA (ยาวประมาณ 20 bp) เป็นไปได้โดยหลักแล้ว อย่างไรก็ตาม เราขอแนะนำวิธีการสังเคราะห์ siRNA ทางเคมีสำหรับ dsRNA สั้นๆ ชุดทดสอบประกอบด้วยรีเอเจนต์เพียงพอสำหรับปฏิกิริยา 50 ปฏิกิริยา โดยแต่ละปฏิกิริยามีปริมาตร 20 μl (7.5 mM ต่อ NTP) ปฏิกิริยา 20 μl จะให้ผลลัพธ์> dsRNA 40 ไมโครกรัม (> 2 มก./มล.) หลังจากฟักเป็นเวลา 30 นาที (เทมเพลตควบคุม T7 I และ II ละ 1 ไมโครกรัม ทรานสคริปต์ RNA 0.5 กิโลเบส) อย่างไรก็ตาม ผลผลิตอาจแตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับเทมเพลต (การออกแบบโปรโมเตอร์ ความยาวของลำดับ การสร้างโครงสร้างรอง) เนื้อหา: HighYield T7 RNA Polymerase Mix 3x 40 ไมโครลิตร รวม สารยับยั้ง RNase และกลีเซอรอล 50% (v/v) บัฟเฟอร์ปฏิกิริยา HighYield T7 1x 200 μl (10x), ATP ที่ใช้ HEPES – สารละลาย 1x 100 μl (100 mM) GTP – สารละลาย 1x 100 μl (100 mM) CTP – สารละลาย 1x 100 μl (100 mM) UTP – สารละลาย 1x 100 μl (100 mM) น้ำเกรด PCR 1x 1.2 มล. DTT 1x 150 μl (100 mM) DNase I สารละลาย 1x 60 μl (1 u/μl) RNase A สารละลาย 1x 200 μl (4 mg/ml) โซเดียมอะซิเตท สารละลาย 1x 1 มล. (3 M) เทมเพลตควบคุมการริเริ่ม G I ของ T7 1 (0.5 kbp) 10 μl (0.5 μg/μl) เทมเพลตควบคุมการเริ่มต้น T7 G II (0.5 kbp) 10 μl (0.5 μg/μl) ให้ผู้ใช้จัดเตรียม เทมเพลต DNA ที่ประกอบด้วยโปรโมเตอร์ T7 ไอโซโพรพานอล 70% เอทานอล หมายเหตุสำคัญ (อ่านก่อนเริ่มต้น) การป้องกันการปนเปื้อนของ RNAse แม้ว่าจะมีสารยับยั้ง RNase ที่มีประสิทธิภาพรวมอยู่ด้วย แต่การสร้างสภาพแวดล้อมการทำงานที่ปราศจาก RNAse และการรักษาสารละลายที่ปราศจาก RNAse ถือเป็นสิ่งสำคัญสำหรับการทำปฏิกิริยาการถอดรหัส ในหลอดทดลอง ให้ประสบความสำเร็จ ดังนั้นเราจึงขอแนะนำ

• เพื่อทำปฏิกิริยาทั้งหมดในหลอดปลอดเชื้อที่ปราศจาก RNAse โดยใช้ปลายปิเปตที่ปลอดเชื้อ
• ให้สวมถุงมือเมื่อต้องสัมผัสตัวอย่างที่มีสาร RNA
• เพื่อให้ส่วนประกอบทั้งหมดถูกปิดสนิททั้งในระหว่างการเก็บรักษาและขั้นตอนปฏิกิริยา

ข้อกำหนดเทมเพลต

• • ประเภทเทมเพลต : ดีเอ็นเอพลาสมิดเชิงเส้นหรือผลิตภัณฑ์ PCR ที่ประกอบด้วยโปรโมเตอร์คลาส II phi2.5 T7 สองสายหรือคลาส III phi6.5 บริเวณต้นน้ำของลำดับเป้าหมาย ลำดับโปรโมเตอร์ T7 ขั้นต่ำ: โปรโมเตอร์คลาส III phi6.5 T7 5′-TAATACGACTCACTATA G NN …-3′ ตัวหนา: เบสแรกที่รวมเข้าใน RNA, NN : ในอุดมคติคือ CG หรือ โปรโมเตอร์คลาส II phi2.5 T7 5′-TAATACGACTCACTATT A NN …-3′ ตัวหนา: เบสแรกที่รวมเข้าใน RNA, NN : ในอุดมคติคือ GG
  • กลยุทธ์เทมเพลต:

 

ตัวเลือกที่ 1: เตรียมเทมเพลต DNA ที่เหมือนกันสองอันโดยมีโปรโมเตอร์ T7 ตัวเดียวที่ปลายตรงข้ามของบริเวณที่จะถอดรหัส สามารถดำเนินการปฏิกิริยาการถอดรหัส ในหลอดทดลอง ของแต่ละเทมเพลตเพื่อให้ได้โมเลกุล ssRNA ที่เสริมกัน จำเป็นต้องมีขั้นตอนการอบเพิ่มเติม หรืออีกวิธีหนึ่งคือถอดรหัสเทมเพลตทั้งสองพร้อมกันในปฏิกิริยาเดียว ในกรณีนี้ dsRNA และการรวมกลุ่มที่ไม่จำเพาะมักเกิดขึ้นโดยตรง การก่อตัวของการรวมกลุ่มสามารถแก้ไขได้โดยทำขั้นตอนการเปลี่ยนสภาพและอบเพิ่มเติม ตัวเลือกที่ 2: เตรียมเทมเพลต DNA ตัวหนึ่งที่มีโปรโมเตอร์ T7 ตรงข้ามที่ปลาย 5′ ของแต่ละสาย dsRNA และการรวมกลุ่มที่ไม่จำเพาะมักเกิดขึ้นโดยตรงในระหว่างการถอดรหัส ในหลอด ทดลอง การก่อตัวของการรวมกลุ่มสามารถแก้ไขได้โดยทำขั้นตอนการเปลี่ยนสภาพและอบเพิ่มเติม  

• คุณภาพเทมเพลต : คุณภาพเทมเพลตของ DNA ส่งผลโดยตรงต่อผลผลิตและคุณภาพของปฏิกิริยาการถอดรหัส DNA พลาสมิดเชิงเส้นต้องถูกย่อยอย่างสมบูรณ์และปราศจาก RNase โปรตีน และเกลือที่ปนเปื้อน เราแนะนำให้เลือกเอนไซม์จำกัดที่สร้างปลายทู่หรือส่วนยื่น 5′ และทำการทำให้บริสุทธิ์โดยการสกัดฟีนอล/คลอโรฟอร์ม สามารถใช้ส่วนผสม PCR ได้โดยตรง อย่างไรก็ตาม มักจะได้ผลผลิตที่ดีกว่าด้วยผลิตภัณฑ์ PCR ที่บริสุทธิ์แล้ว (เช่น ผ่านคอลัมน์การทำให้บริสุทธิ์ที่ใช้ซิลิกาเมมเบรน)

โปรโตคอลการถอดรหัส ในหลอด ทดลอง โปรโตคอลได้รับการปรับให้เหมาะสมสำหรับเทมเพลต DNA ขนาด 1 μg (โปรดดู “หมายเหตุสำคัญ” เกี่ยวกับข้อกำหนดเทมเพลต)

• วาง HighYield T7 RNA Polymerase Mix ลงบนน้ำแข็ง
• ละลายส่วนประกอบที่เหลือทั้งหมดที่อุณหภูมิห้อง (RT) ผสมโดยใช้ voretexing และปั่นสักครู่
• ประกอบส่วนประกอบทั้งหมดที่อุณหภูมิห้องลงในไมโครทิวบ์ที่ปราศจากนิวคลีเอส (ปลายปิเปตที่ปลอดเชื้อ) ตามลำดับต่อไปนี้:
• ผสมน้ำเกรด PCR, บัฟเฟอร์ปฏิกิริยา HighYield T7 และ DTT โดยใช้ voretexing แล้วปั่นสักครู่
• เติมสารละลายนิวคลีโอไทด์และเทมเพลต DNA ลงไป วอร์เท็กซ์และสปินลงมาสั้นๆ
• เติม HighYield T7 RNA Polymerase ลงในเครื่องปั่นและปั่นลงสักครู่
• ฟักที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 0.5 ชั่วโมงในที่มืด (เช่น เครื่อง PCR cycler) ขึ้นอยู่กับลำดับ RNA การเพิ่มประสิทธิภาพของแต่ละบุคคลอาจเพิ่มผลผลิตได้ (0.5–4 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37°C)

 

 

 

ขั้น ตอนการอบอ่อน/การเตรียม dsRNA ขอแนะนำขั้นตอนอบอ่อนที่ไม่ขึ้นอยู่กับกลยุทธ์เทมเพลต การอบอ่อนที่ประสบความสำเร็จขึ้นอยู่กับปริมาณของ ssRNA ที่เกือบเท่ากัน หากอบอ่อน ssRNA จากปฏิกิริยาการถอดรหัส ในหลอดทดลอง แยกกัน (ดู “กลยุทธ์เทมเพลต ตัวเลือกที่ 1”) ก่อนอื่น ให้ตรวจสอบประสิทธิภาพการถอดรหัสของ ssRNA แต่ละตัวด้วยอิเล็กโทรโฟรีซิสเจลอะกาโรส

• ผสม ssRNA ที่เป็นส่วนเติมเต็มในปริมาณที่เท่ากันในกรณีที่มีประสิทธิภาพการถอดรหัสใกล้เคียงกัน หรือปรับอัตราส่วนปริมาตรให้เหมาะสม
• ฟักที่อุณหภูมิ 70°C เป็นเวลา 10 นาที แล้วปล่อยให้เย็นลงอย่างช้าๆ จนถึงอุณหภูมิห้อง (ประมาณ 20 นาที)
• อย่าวางปฏิกิริยาบนน้ำแข็ง การอบของ dsRNA จะเกิดขึ้นระหว่างการคลายความเย็น

การกำจัดเทมเพลต DNA และ ssRNA

• เจือจาง RNase A Solution 1:200 ด้วยน้ำเกรด PCR (เตรียมเจือจางสดใหม่ทุกครั้ง)
• ปิเปต 1 μl สารละลาย RNase A ที่เจือจางและ 1 μl DNase I ถึง 20 μl ปฏิกิริยาการอบอ่อน ในหลอดทดลอง
• ฟักที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 30 นาที
• ทิ้งสารละลาย RNase ที่เจือจางแล้ว

การทำให้บริสุทธิ์ของ dsRNA

• เติม 0.1 ปริมาตรของ 3 M Sodium Acetate (pH 5.2) และ 1 ปริมาตรของไอโซโพรพานอลลงในปฏิกิริยา dsRNA
• ผสมให้เข้ากันแล้ววางบนน้ำแข็งประมาณ 5 นาที
• ปั่นด้วยความเร็วสูงสุด 10 นาทีในเครื่องไมโครเซนตริฟิวจ์ ควรมองเห็นเม็ดสีขาว
• ปิเปตเอาของเหลวส่วนบนออกอย่างระมัดระวัง แล้วล้างเม็ดตะกอนด้วยเอธานอล 70% ปริมาตร 500 μl โดยหมุนหลอดปฏิกิริยา
• ปิเปตเอาเอธานอลออกให้หมดแล้วทำให้เม็ดแห้งเป็นเวลา 15 นาทีโดยเปิดหลอดไว้
• ทำให้ dsRNA กลับสู่สภาพเดิมในปริมาตร 2-5 เท่าของปริมาตรเริ่มต้นด้วยน้ำเกรด PCR

การวัดปริมาณ RNA ความเข้มข้นของ RNA สามารถกำหนดได้โดยการวัดการดูดกลืนแสงที่ 260 นาโนเมตร (A ₂₆₀ ) ตามกฎของเบียร์ Lambert (A ₂₆₀ = 1 สอดคล้องกับ 40 μg/ml dsRNA)